TROP2在三阴性乳腺癌中高表达，可作为液体活检生物标志物_技术教程

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揭示三阴性乳腺癌特性，TROP2或是液体活检新型标志物。

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，2022年GLOBOCAN流行病学数据显示，乳腺癌在女性癌症新发病例和死亡人数中分别占据了23.8%和15.4%的比例，均高居首位^[1]，严重威胁女性健康。与其他乳腺癌亚型相比，三阴性乳腺癌（TNBC）是一类异质性很强的疾病，常见于年轻女性，具有分化差、侵袭性强、更早且更易发生复发转移的特点，超过1/3的三阴性乳腺癌患者会发生复发或远处转移^[2]。TNBC通常预后较差，5年生存率为78.5%^[3]，显著低于乳腺癌患者整体5年生存率(91%)^[4]。

已有靶向钙转导跨膜蛋白滋养层细胞表面抗原2（TROP2）的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate,ADC)戈沙妥珠单抗获批用于三阴性乳腺癌的治疗,显著改善其预后,但仍存在诸多未知问题需通过临床研究进一步验证^[5]。2024年美国临床肿瘤学会（ASCO）大会上，针对TNBC领域的ADC研究进展显著，特别是围绕TROP2这一重要靶点取得了多项突破性成果^[6-8]。Trop-2在正常组织中表达水平较低，在许多恶性肿瘤，特别是TNBC中表达水平较高，使其成为潜在的抗癌治疗靶点。TROP2参与导致肿瘤发展、侵袭和转移的几种致癌信号通路，并可增强上皮-间充质转化（EMT）并促进肿瘤转移，且与不良预后相关。

一项研究对60个TNBC组织切片进行了深入研究，旨在更深入地了解TROP2表达水平与TNBC的相关性以及TROP2作为TNBC中循环肿瘤细胞（CTCs）新型标志物的适用性和有效性^[9]。本文特将研究重点梳理如下，以飨读者。

研究背景

TNBC作为乳腺癌中最具侵袭性的亚型，缺乏有效的靶向治疗方案，具有高复发、高内脏转移率和短生存期等特点。因此，早期诊断和监测对改善TNBC患者预后至关重要。

与组织活检相比，液体活检是肿瘤诊断、反应监测和预后评估的良好工具。液体活检的优势包括无创采样和可重复性。液体活检涉及检测循环生物标志物，如CTCs、循环肿瘤DNA（ctDNA）、细胞外囊泡和循环微RNA的监测。CTCs是从实体瘤脱落并进入外周血循环的肿瘤细胞，它们携带有重要的基因组、转录组、蛋白质组和代谢组信息。既往研究表明，异质性CTC群体，如经历EMT且EpCAM水平低或不可检测的亚组，可能具有高度侵袭性和转移性。而仅基于EpCAM抗体的CTCs的富集方法很难捕获不同类型的CTCs。此外，肿瘤的异质性导致了检测灵敏度的降低，这对CTCs的检测构成了挑战。发现新的标志物对捕获更多类型的CTC亚组，并确定更全面和有效的CTC检测方法的替代标记物至关重要。

研究目的

本研究旨在探讨TROP2表达水平与乳腺癌细胞EMT相关生物学行为之间的相关性。此外，探索了与经典EMT标志物相比，TROP2作为TNBC中CTCs新型标志物的适用性和有效性。

试验方法与研究结果

TROP2在TNBC中高度表达，并与预后不良有关

RNA测序数据表明，由TACSTD2基因编码的肿瘤抗原TROP2是正常组织和肿瘤组织之间差异表达最显著的蛋白质之一。

如图1A所示，TACSTD2基因编码的TROP2在乳腺癌组织中的转录表达水平明显高于其邻近的正常乳腺组织。此外，TROP2在TNBC中的蛋白表达水平高于其他亚型（图1B）。并且，乳腺癌组织切片的IHC结果显示，TROP2表达水平在TNBC中显著上调，并与较高的TNM分期呈正相关（图1C和1D）。此外，Kaplan-Meier图显示，TACSTD2表达较高的TNBC患者预后较差（图1E）。这些数据表明TNBC中TROP2的表达水平增加与TNBC患者的预后较差密切相关。

图一.TROP2在TNBC中高度表达，并与预后不良有关

TROP2表达或与肿瘤进展有关

使用qRT-PCR进一步验证ER+乳腺癌细胞系MCF-7；HER2⁺乳腺癌细胞系SK-BR3；TNBC细胞系MDA-MB231、MDA-MB453、MDA-MB468和BT549细胞、及正常乳腺上皮细胞MCF-10A中TROP2的表达水平。

结果与数据库基本一致。与MCF-10A相比，TROP2在MDA-MB468和MDA-MB231细胞中表达水平较高，而在BT549细胞中的表达水平较低（图2A）。TROP2的高表达已被证明有助于肿瘤的增殖和转移。为了评估TROP2是否影响乳腺癌细胞的生物学行为，使用相应的慢病毒使TROP2在BT549细胞中过表达，并在MDA-MB231细胞中低表达（图2B）。采用qRT-PCR检测这些细胞中的EMT和细胞增殖标志物。TROP2过表达导致波形蛋白、cyclinD1、c-myc和sox2的mRNA表达水平增加。相反TROP2敲低导致这些标记物的mRNA表达水平降低（图2C）。

图二.TROP2的表达水平影响肿瘤进展标志物的表达水平

TROP2通过上调TNBC细胞中的间充质标记物来促进侵袭

有证据表明TROP2促进胃癌的侵袭。为了探索TROP2在TNBC中是否具有相同的功能，对基因表达进行了TCGA数据库分析，以验证假设，即TACSTD2基因与EMT相关分子或信号通路显著相关。TROP2与EMT标记物和转化生长因子b（TGF-b）EMT相关信号通路呈正相关（图3A）。Western blotting结果显示，TROP2的过表达或敲低分别诱导N-钙粘蛋白和波形蛋白的上调和下调（图3B）。此外，伤口愈合测定结果显示，与对照相比，TROP2的过表达显著促进了BT549细胞的迁移。相反，短发夹RNA（ShRNA）敲低TROP2显著减弱了MDA-MB231细胞的迁移（图3C和3D）。评估细胞迁移和侵袭能力的Transwell实验结果表明，TROP2过表达可显著提高BT549细胞的迁移和侵袭力。相反，TROP2的敲低降低了MDAMB231细胞的迁移和侵袭能力（图3E和3F）。综合以上结果表明，TROP2通过上调EMT促进TNBC细胞的侵袭和迁移，这表明TROP2可以与EMT相关标志物或其他经典CTC测定标志物结合使用，以提高CTC检出率。

图3.TROP2通过上调TNBC细胞中的间充质标记物来促进侵袭

TROP2在TNBC细胞中的表达水平

使用qRT-PCR方法检测TNBC细胞系中TROP2的表达水平。与MCF-10A细胞相比，TROP2在乳腺癌细胞系中均有检测到表达，特别是在TNBC细胞系MDA-MB468、MDA-MB231和MDA-MB453中（图2A），表明TROP2可能是检测乳腺癌细胞的合适标志物。目前，已有TROP2靶向ADC被用于某些类型实体瘤的治疗。

此外，TROP2与经典肿瘤标志物EpCAM属于相同的TACSTD基因家族。采用流式细胞术和细胞免疫荧光（IF）鉴定TNBC细胞和MCF-10A中TROP2和EpCAM表达（图4A和4B）。通过IF分析它们在来自健康对照的外周血单核细胞（PBMCs）中的表达，以确定它们作为CTCs的新生物标志物的特异性（图4C）。Western blot结果还显示TROP2在MCF-10A细胞和PBMC中低表达或不表达。随后，使用加标测定法检测TROP2对肿瘤细胞捕获和鉴定的潜在适用性。结合之前描述的TROP2在TNBC中的高表达及其影响EMT的能力，研究结果表明TROP2有可能作为识别的TNBC CTCs的辅助标记物，从而协助检测更多潜在的转移性CTCs。后续使用成熟的CanPatrol CTC检测平台对TROP2作为TNBC患者血液样本中新型CTC标志物候选分子的临床适用性进行验证。结果证实TROP2的表达水平与间充质标志物的表达水平呈正相关，表明TROP2具有检测TNBC患者中间充质相关的CTC的潜力。

图4.TROP2在TNBC细胞中的表达

研究结论

TROP2在TNBC中表达较高，并促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。TROP2作为TNBC中EMT CTCs潜在生物标志物的特异性和适用性在细胞系和临床血液样本中得到了验证。

本研究不仅为TNBC早期诊断提供了潜在的生物标志物，还提示以TROP2为靶点的药物研发，有望推动TNBC靶向治疗的进步，为患者带来更为有效、精准的治疗方案，从而提升患者的治疗效果和生活质量。

参考文献：

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[2].Caparica R, Lambertini M, de Azambuja E. How I treat metastatic triple-negative breast cancer. ESMO Open. 2019 May 13;4(Suppl 2):e000504.

[3].Hennigs A,et al. Prognosis of breast cancer molecular subtypes in routine clinical care: A large prospective cohort study. BMC Cancer. 2016 Sep 15;16(1):734.

[4].https://www.cancer.org/cancer/types/breast-cancer/understanding-a-breast-cancer-diagnosis/breast-cancer-survival-rates.html（访问日期：2024年9月23日）

[5].《中国晚期三阴性乳腺癌临床诊疗指南(2024版)》

[6].Jane Lowe Meisel ,et al.Rates of pathologic complete response (pCR)after neoadjuvant datopotamab deruxtecan (Dato): Results from the I-SPY2.2 trial.J Clin Oncol 42, 2024 (suppl 17; abstr LBA509)

[7].Rebecca Arielle Shatsky ,Rates of pathologic complete response (pCR) after datopotamab deruxtecan (Dato) plus durvalumab (Durva) in the neoadjuvant setting: Results from the I-SPY2.2 trial.J Clin Oncol 42, 2024 (suppl 17; abstr LBA501)

[8].Binghe X.Sacituzumab tirumotecan (SKB264/MK-2870) in patients (pts) with previously treated locally recurrent or metastatic triple-negative breast cancer (TNBC): Results from the phase III OptiTROP-Breast01 study.J Clin Oncol 42, 2024 (suppl 16; abstr 104)

[9].Liao Q, Zhang R, Ou Z, Ye Y, Zeng Q, Wang Y, Wang A, Chen T, Chai C, Guo B. TROP2 is highly expressed in triple-negative breast cancer CTCs and is a potential marker for epithelial mesenchymal CTCs. Mol Ther Oncol. 2024 Jan 10;32(1):200762.

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