9分SCI!网络药理学的优秀答卷!干湿结合+逻辑新颖!复刻超容易!
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网络药理学还能发文吗？从2020年以来网络药理学相关的SCI真的是蹭蹭蹭的往上涨！这几年网药的文章真的卷出了新天地！大家感叹网药的SCI是越来越难发了！那么今天小云带来一篇关于网药的SCI!
首先，这篇SCI占据了一个大优势就是干湿结合了，干湿结合已经是不言而喻的大趋势了！相应的实验可以起到更强的说服力！第二点是对于成分的收集以及预测也是采用实验＋数据库的形式！采用超高效液相色谱-高分辨率质谱（UPLC-HRMS）对YQHX处方中的化合物进行鉴定和定量。随后，结合疾病数据库筛选关键化合物，预测关键靶点。这点对于只是利用数据库收集成分信息来说，优势是非常大！第三，在整体思路以及逻辑上也是比较新颖！区别于一开始就利用网药技术进行预测以及验证的文章，对比之下这篇SCI的逻辑思路更加新颖。
这篇研究开发了一种益气火药（YQHX）处方，网络分析结合超高效液相色谱-高分辨率质谱分析阐述了YQHX的活性成分，体内和体外实验证实YQHX可以通过改善线粒体的结构和功能来缓解缺氧/复氧损伤，减轻氧化应激。总的来说，干湿结合大优势+逻辑新颖，提供了更强的准确性和可靠性。而且真的超容易复刻！（ps：想了解更多生信分析思路的同学，赶快找小云，更多创新思路等着你来学习！）
- 题目：整合网络分析和实验验证，揭示益气火雪（YQHX）处方治疗心肌缺血/再灌注损伤的线粒体自噬相关机制
- 杂志：Pharmacological Research
- 影响因子：IF= 9.3
- 发表时间：2023年3月
研究背景
据报道，急性心肌梗死(AMI)是全球死亡的首要原因。虽然血运重建是挽救AMI患者生命的有效和关键手段，但随之而来的心肌缺血/再灌注(I/R)损伤不可避免。血运重建后，当氧被重新供给缺氧的心肌细胞时，血流突然恢复，对缺血心肌细胞是有害和致命的。这也是增加缺血后心力衰竭的主要原因，导致了随访的住院时间和高昂的治疗费用。然而，尽管I/R损伤在临床前研究中取得了潜在和有前景的结果，但目前还没有确切的、有强有力临床证据的治疗措施。因此，探索和开发减轻心肌I/R损伤的新型药物疗法仍有必要。
数据来源
研究思路
本研究开发了一种中草药配方，开发了一种益气火药（YQHX）处方，并显示出可以缓解I/R损伤。网络分析结合超高效液相色谱-高分辨率质谱分析阐述了YQHX的活性成分，揭示了YQHX治疗I/R损伤的线粒体自噬调控机制。体内实验证实YQHX显著缓解I/R心肌损伤，缓解氧化应激。体外实验证实，YQHX可以通过改善线粒体的结构和功能来缓解缺氧/复氧损伤，减轻氧化应激，线粒体与调节线粒体自噬密切相关。
主要结果
1.YQHX对体内心肌I/R损伤模型的影响
为验证YQHX对心肌I/R损伤的保护作用，采用体内心肌I/R损伤模型。如图1A和B所示，I/R模型组心肌梗死面积为36.9%，说明I/R损伤模型构建成功。与I/R损伤模型组相比，MYQHX组和HYQHX组心肌梗死面积显著减少。此外，H&E染色结果（图1C）在心肌I/R损伤模型组中呈现心肌破坏伴心肌纤维紊乱、心肌肿胀和炎症浸润的明显病理特征。然而，随着不同剂量YQHX中YQHX剂量的增加，心肌结构的组织学特征得到改善，成为正常心脏结构或轻度结构损伤的典型特征。因此，上述结果表明，YQHX可以缓解体内心肌I/R损伤。
乳酸脱氢酶 （LDH） 和肌酸激酶 （CK）升高是心肌损伤的特征性生物标志物，与假手术组比较，心肌I/R损伤模型组CK和LDH明显升高。此外，YQHX预先给药显著降低了血清CK和LDH水平。以上结果表明，YQHX可以降低心肌I/R损伤小鼠模型中心肌损伤标志物CK和LDH的水平(图1D, E)。
YQHX可能通过缓解氧化应激来缓解心肌I / R损伤。因此，评估了ROS副产品MDA的水平和ROS清除剂的主要来源SOD的水平。与假手术组相比，I/R损伤模型组MDA水平显著升高，SOD水平显著降低。与I/R损伤模型组相比，YQHX预处理显著降低MDA水平，增加SOD水平（P < 0.001）。这些结果表明，YQHX可以改善心肌I/R损伤小鼠模型中的氧化应激指标SOD和MDA（图1F，G）。
图 1 YQHX对体内心肌I/R损伤的影响
2.YQHX治疗心肌I/R损伤的网络分析
UPLC-HRMS用于建立YQHX的质量控制并鉴定YQHX的化合物。典型的碱峰和离子流色谱如图2 A所示，根据标准品和相关数据库，最初共鉴定了YQHX的23种主要化合物（图2 A）。化合物类别包括有机氮化合物、嘌呤核苷、羧酸及其衍生物、吲哚及其衍生物、异黄酮类、类黄酮、有机氧化合物、酚类、异戊烯醇脂类、羟基酸及其衍生物、羧酸及其衍生物。
从数据库和文献中共收集了YQHX中含有的495种化合物。随后，通过获取UPLC-HRMS和上述数据库的结果的交集，筛选了23种核心化合物（图2 A）。根据上述方法预测和筛选这803种核心化合物的23个推定靶点（图2B）。此外，根据上述方法，从DisGeNET，Genecards，TTD和CTD获得了1071个治疗I / R损伤的治疗靶点（图2B）。为了探究YQHX在心肌I/R损伤中的潜在靶点，生成了维恩图。最后，237个共同靶点被认为是YQHX对抗心肌I/R损伤的潜在靶点（图2B）。
为了进一步评估潜在目标的重要性，将237个共同目标上传到STRING 11.0数据库进行分析。将237个靶点纳入网络拓扑分析（也称为蛋白质-蛋白质相互作用分析），构建相互作用网络。该网络由237个节点和1601条边组成，平均节点度数为13.5。在网络拓扑分析和上述筛选原理的基础上，选取拓扑特征值大于中位数的90个关键目标（图2C）。
图 2 YQHX治疗心肌I/R损伤的网络分析
3.关键目标的丰富和模块化分析。
为了阐明这90个关键靶标的潜在功能，使用Metascape平台进行了基因注释和功能富集分析（图3）。前15个GO生物过程涉及治疗心肌I / R损伤的四个主要方面，包括减轻氧化应激，抑制细胞凋亡，抑制炎症和调节自噬（图3B）。此外，前15个GO分子功能与蛋白激酶活性、蛋白结构域特异性结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合、一氧化氮合酶调节活性等有关（图3B）。此外，前15名GO细胞成分是膜微域、线粒体包膜、溶酶体、线粒体膜等（图3B）。此外，KEGG信号通路的富集表明，YQHX治疗心肌I/R损伤主要涉及：细胞死亡相关信号通路（如细胞凋亡和坏死性凋亡）、内分泌阻力相关信号通路、炎症反应相关信号通路（如TNF、toll样受体、NOD样受体和MAPK通路）和自噬相关信号通路（如自噬、线粒体自噬、吞噬体和mTOR通路）（图3A)。
为了进一步研究潜在的机制，应用MCODE算法构建了一个模块网络来揭示核心治疗靶点。使用MCODE算法从PPI网络中识别出高度相关的网络目标，共产生了5个显著的聚类(图3C)。利用Metascape进行功能富集分析，探索不同聚类中靶点的潜在功能。前3位的细胞成分包括线粒体外膜、线粒体膜和细胞器外膜。此外，分子功能与泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合和蛋白结构域特异性结合相关(图3D)。此外，富集最显著的KEGG信号通路是线粒体自噬-动物(图3E)。益气活血方治疗心肌I/R损伤的机制可能与减轻氧化应激和调节自噬有关。
图 3 关键目标的丰富和模块化分析
4.通过分子对接验证所鉴定化合物与关键靶点之间的相互作用
采用分子对接方法验证YQHX中已鉴定成分与关键靶点的亲和力，如图4A所示。由图4B可知，CID44715618、柚皮苷、毛蕊异黄酮-7-o- β -d-葡萄糖苷和人参皂苷F1在与上述关键靶点的结合中起主导作用，对它们具有较强的结合能力。图4B为各关键靶点与对应组分最稳定的一对代表性分子对接结果。
图 4 分子对接结果
6.验证YQHX在体外H/R损伤模型上的潜在机制
H/R损伤模型已被公认为体外模拟I/R损伤的经典和理想模型。CCK8测定表明，与对照组相比，H/R干预显著降低了H9c2细胞的相对活力。如图5A和B所示，结果表明，与H/R模型组相比，YQHX治疗减轻了H/R损伤引起的相对生存力的降低。此外，H/R损伤组的心脏损伤生物标志物CK和LDH也比对照组显著增加。相比之下，阳性对照组（ADO组）与H/R损伤组相比逆转了上述CK趋势。此外，与H/R损伤组相比，不同剂量的YQHX降低了CK和LDH水平。综上所述，YQHX提高了H9c2细胞的相对活力，并降低了H / R损伤体外模型中CK和LDH的水平（图5C，D）。
为了研究氧化应激，检测了经典氧化应激生物标志物MDA和SOD的水平。与体内实验结果一致，MDA水平显著升高，作为经典氧化应激生物标志物的SOD水平与对照组相比显著降低。相比之下，阳性对照组（ADO组）与H/R损伤组相比，MDA和SOD的上述趋势逆转（P <0.05）。此外，与H/R损伤组相比，不同剂量的YQHX显著降低了MDA水平，并以剂量依赖性方式增加了SOD水平（图5E，F）。由于ROS在激活氧化应激中的关键作用，通过流式细胞术测定了ROS的DCFH-DA荧光强度。如图5G所示，H/R损伤组ROS的荧光强度明显高于对照组。与H/R损伤组相比，ADO处理显著降低了ROS的荧光强度。此外，与H/R损伤组相比，不同剂量的YQHX治疗不同程度地降低了ROS的荧光强度。基于上述结果，YQHX通过减少ROS的产生和改善氧化应激指数SOD和MDA来缓解H/R损伤体外模型中的氧化应激。
图 5 YQHX对体外H/R损伤的影响
7.YQHX 改善了 H/R 损伤模型中的线粒体功能障碍
过量的ROS生成会损害线粒体功能，导致心肌细胞进一步再灌注损伤。ATP的产生是一种重要的线粒体功能;因此，检测到ATP含量。结果表明，与对照组相比，ATP含量明显降低。与H/R损伤组相比，ADO治疗显著提高了ATP含量。此外，与H/R损伤组相比，不同剂量的YQHX治疗以剂量依赖性方式显着增加了ATP含量。MMP是线粒体呼吸功能的另一个重要指标。因此，通过TMRM测量各组的MMP荧光强度。如图6A所示，H/R损伤组的MMP荧光强度与对照组相比明显降低。与H/R损伤组相比，ADO处理显著提高了荧光强度。此外，与H/R损伤组相比，MYQHX组和HYQHX组的荧光强度显著增加。根据MMP和ATP产生的结果，YQHX保护H9c2细胞的线粒体功能免受H / R损伤（图6B，C）。
图 6 YQHX对玻璃体H/R损伤线粒体功能的影响
8.YQHX 保护线粒体的形态，防止自噬体 （AP） 和自噬溶酶体 （ASS） 的产生免受 H/R 损伤
为了进一步探讨YQHX对H/R损伤的线粒体是否具有保护作用，采用TEM观察各组线粒体形态。如图7A所示，计算自噬体（AP）和自噬溶酶体（ASS）的数量，与对照组相比，H/R损伤组的自噬体（AP）和自噬溶酶体（ASS）数量显着增加。然而，与H/R损伤组相比，ADO和不同剂量YQHX治疗组的AP和ASS量显着降低（图7A）。此外，H/R损伤导致线粒体形态发生明显变化，细胞器平均长度和宽度增加（P < 0.05）。与对照组线粒体完整结构相比，H/R损伤组线粒体表现出空泡化，嵴线粒体被破坏。相比之下，ADO和不同剂量的YQHX处理改善了线粒体形态，其平均长度和宽度均显著降低（图7B）。基于透射电镜结果，YQHX保护了线粒体的形态，抑制了H/R损伤体外模型中AP和ASS的生成。
图 7 YQHX对体外H/R损伤线粒体自噬的影响
9.YQHX 抑制了 H/R 损伤模型中自噬和线粒体自噬靶点的表达
根据网络分析和现有证据筛选的关键靶点，YQHX可能通过调节自噬和线粒体自噬来减轻H/R损伤。因此，通过蛋白质印迹检测自噬和线粒体自噬相关靶标的蛋白表达。首先，测定经典和代表性的自噬相关蛋白（mTOR，Beclin1，p62和LC3B）。与对照组相比，H/R损伤组mTOR和p62的相对蛋白表达水平显著降低，而Beclin1和LC3BII/LC3BI比值的表达水平显著增强。相比之下，与H/R损伤组相比，上述蛋白质在ADO和不同剂量YQHX组中的表达趋势显著逆转（图8A-F）。
此外，线粒体自噬（动物）是KEGG通路富集分析的另一个关键结果，YQHX可以改善H/R损伤模型中的线粒体功能和结构，因此假设YQHX可能通过抑制线粒体自噬来赋予线粒体保护。因此，确定了主要的线粒体自噬相关蛋白（PINK1，Parkin，BNIP3和Nix）。与对照组相比，H/R损伤组PINK1、Parkin、BNIP3和Nix的相对表达水平显著增强。然而，与H/R损伤组相比，上述蛋白质的相对表达显著降低（图8G-K）。根据上述结果，YQHX可能通过抑制H / R损伤体外模型中的自噬和线粒体自噬对H9c2细胞功能和结构发挥保护作用。
图 8 YQHX对体外H/R损伤预测靶点表达的影响
文章小结
目前，还是有非常多的网药文章逻辑单一，例如：网药预测＋体内/外实验验证或者只有网药预测，这些文章结构比较单薄！这篇SCI先验证了研发的中药配方具有效应，在联合网药技术以及液质探究相应成分并进行了药理学的预测，最后根据预测结果进行进一步的验证。逻辑上比较新颖，再加上体内外双验证，提供了更强的准确性和可靠性。
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