从小白的角度，一刻钟复现生信套路。各位小伙伴大家好，这里是美丽专栏。经过两期的零代码复现课，相信大家一定对肿瘤领域的单基因套路有一定的了解，最近也有小伙伴私聊美丽，希望掌握一些非肿瘤领域的生信文章，作为新一代宠粉达人，这样的需求，美丽当然是满足啦。接下来，美丽带大家康康如何在非肿瘤领域进行省心研究，话不多说，开始今天的复现之旅吧。
文章复现是生信小白成长为大神的最佳路径。在本篇文章中，美丽将会手把手教您3图4表逐个步骤的文章复现。
今天为大家带来一篇2020年3月份发表于Frontiers of endocrinology（影响因子：3.644）的单基因非肿瘤生信文章套路复现。
话不多说，我们开始吧！
题目
Bioinformatic Analysis Identifies Potential Key Genes in the Pathogenesis of Turner Syndrome
材料与方法一：患者数据收集情况
作者从GEO数据库中找到GSE46687数据集，一共包括36例样本，其中，有 16例TS患者被证实具有母系遗传的X染色体(45，Xm)，10例TS患者被证实具有父系遗传的X染色体(45，Xp)，10例正常女性(46，XX)。使用测序平台GPL570。
材料与方法二：图表结果及复现
01
使用工具
1）仙桃学术工具（https://www.xiantao.love/products），
2）BioGPS数据库（http://biogps.org/#goto=genereport&id=177）
3）Cytoscape
4）拼图工具，AI或仙桃。
02
复现任务
TABLE 1 | Differentially expressed genes of Turner Syndrome
表1 寻找TS的差异基因
TABLE 2 | Tissue-specific expressed genes identified by BioGPS
表2 利用BioGPS数据库查找组织特异性基因
TABLE 3 | The enriched terms for DEGs
表3 DEGs富集分析
TABLE 4 | Genes of interest.
表4 最终筛选的基因
FIGURE 1 | A heatmap of 85 differentially expressed genes between monosomy X TS patients and 46,XX normal individuals.
图1 热图展示差异基因
FIGURE 2 | Bar graph of 11 representative enriched functional terms.
图2 条形图展示11个富集功能信息
FIGURE 3 | 寻找hub genes
图3 寻找hub基因
03
复现步骤
图1 热图展示差异基因
首先，打开仙桃学术，点击数据集检索。
在检索框中，输入数据集GSE，随后点击检索。
点击选择样本，根据实验分组，选择前十个样本，设置为正常组Normal。
同样的方式，设置实验1组Case1。
同样的方式，设置实验2组Case2。
随后点击左侧的进入我的样本库。
依次选择分组1（Case），分组2（Normal）。点击右侧提交分析
同样的方法，将分组1改为Case2。提交分析。
稍等片刻，出现分析完成字样，可以先把分析资料下载到本地，随后再进行后续操作。
打开压缩包，点击分析报告
包含多个模块，主要结果部分，可以对分析的差异基因进行筛选。
火山图，热图可以对我们分析的差异基因进行可视化展示。
同样，对于图片中的细节，可以点击细节修改，进行精细化调整，包括修改字体大小，颜色等。
同样，在仙桃工具的高级版中，也有数据集分析模块。
点击火山图，选中差异分析的分组，点击确定。也可以获得热图，并保存。
将结果命名为热图1。
同样的操作步骤，将结果命名为热图2。
随后，根据原文中的设置，寻找两组的差异基因，即log>1，Padjust<0.05。
打开差异分析表格，Case1与正常样本的比较，即为Xm-XX组：
点击筛选，Padj，数字筛选
选择小于0.05
随后，点击logFC，进行数字筛选。
大于1或者小于-1的值
并按照logFC进行降序排列。
取logFC大于1的gene列，另存为Xm-XX Up，
同理，取logFC小于1的gene列，另存为Xm-XX Down。
打开差异分析表格，Case2与正常样本的比较，即为Xp-XX组：
点击筛选，Padj，数字筛选
选择小于0.05
随后，点击logFC，进行数字筛选。
大于1或者小于-1的值
并按照logFC进行降序排列。
取logFC大于1的gene列，另存为Xp-XX Up，
同理，取logFC小于1的gene列，另存为Xp-XX Down。
随后，将上述四组基因，放在一个excel表格中，如下图排序及命名。
选择仙桃工具-基础班-韦恩图，并上传excel文件
点击确认
保存结果。
随后，打开拼图工具，将上述的三张图进行图片拼接。
最终图1就拼好了。
表1 寻找TS的差异基因
阅读原文表1，即可发现，作者将两组差异分析的结果，统一整理到一个表格中，然后只需要分别显示上调or下调基因，这里忍不住再提一下，作者的表格制作方式，比较创新，并且非常精美，值得推荐参考~
我们只需要将韦恩图中获取的交集差异基因，按照这个方式进行排列即可，本部分操作步骤略。
表2 利用BioGPS数据库查找组织特异性基因
随后，作者利用BioGPS数据库，寻找基因的组织特异性表达，作者使用BioGPS(http://biogps.org) 来分析DEGS的组织特异性表达。
筛选的标准为：(1)组织特异性表达水平>中位数的10倍，以及(2)第二高表达水平不到最高水平的三分之一。
具体演示步骤：打开BioGPS数据库，分别将表1中的上调or下调基因输入数据库，然后查找在人体组织中，同样出现特意表达的基因。我们以AGER为例。
输入AGER点击查询。
可以看到，AGER在肺中高表达的。同样的操作，将其他基因输入，最终鉴定了23个在特定组织或器官系统中表达的基因。并整理成表2.
图2 条形图展示11个富集功能信息
这里，作者用Excel进行富集分析，我们可以将基因输入仙桃工具，获取GO富集分析图。
选择仙桃工具-功能聚类-GO|KEGG富集分析，在分子列表中输入基因名称，点击确认。
点击保存结果，在结果中显示获得的基因，随后可以选择GO|KEGG可视化模块。
温馨提示：这里面，美丽选择其中一组up交集进行的通路富集，与作者的分析略有出入，小伙伴学会分析方法即可，不需要太较真为何有的时候复现与原文不一致。我们学习复现，只是为了学会分析思路，并不需要百分之百复现作者原图，毕竟是作者已经发表的文章，哪怕我们原文完整复现，也不能拿来投稿哟。
表3 DEGs富集分析
根据上述GO、KEGG分析，作者最终选择以下通路进行展示。
我们可以直接将上面保存在仙桃工具中的GO|KEGG富集分析表下载，作为结果的展示。
当然，也可以进一步按照作者展示的模式，进行修改。
图3 寻找hub基因
将表1中的基因上传到仙桃工具-交互网络-PPI蛋白互作分析。复制基因至分子列表，基本参数：互作分数默认0.4中可信度，与文中描述一致。点击确认，获取结果。
将基因对应的上调or下调属性列为一个属性列表。
打开cytoscape软件，将上述两个文件分别导入。
导入互作关系列表。
点击OK。
随后，导入属性关系列表。
修改展示风格，按照属性（attribute）进行展示，上调为红色，下调为绿色。保存为图A。
选择MCODE模式
获得两组展示模式。分别点击每种模式下的基因，保存为图B,图C。
在AI或者仙桃工具中完成拼图工作。最终获得图2如下。
表4 最终筛选的基因
根据上面MCODE获取的Hub Gene，作者最终选择上述6个上调基因，10个下调基因作为最终纳入的Hub gene。
好了，以上是复现步骤。
全文总结
最后一个模块：根据本文的图表进行逻辑梳理
挑TABLE 1 | Differentially expressed genes of Turner Syndrome（表1，寻找TS的差异基因）
挑&靠TABLE 2 | Tissue-specific expressed genes identified by BioGPS( 表2利用BioGPS数据库查找组织特异性基因)
联TABLE 3 | The enriched terms for DEGs(表3DEGs富集分析)
挑TABLE 4 | Genes of interest.（表4 最终筛选的基因）
挑FIGURE 1 | A heatmap of 85 differentially expressed genes between monosomy X TS patients and 46,XX normal individuals.（图1 热图展示差异基因）
圈FIGURE 2 | Bar graph of 11 representative enriched functional terms.（图2 条形图展示11个富集功能信息）
联FIGURE 3寻找hub genes（图3 寻找hub基因）
作者利用GEO数据库，特别是特纳综合征的数据集，包含表达谱数据，虽然没有临床信息，但是作者巧妙的用了一个BiosGPS数据库，用人体组织代替临床信息，非常讨巧的思路，值得借鉴。随后，进行多轮Hub gene的筛选，将挑圈联靠应用到极致，并最终获得与特纳综合征相关的上下调分子。
本文的另一个亮点是对于数据信息的整理，条例逻辑非常清晰，虽然也是凑图，但是凑得特别有逼格，非常值得借鉴。
可以说，虽然本文是非肿瘤生信文章，但是研究套路，总体上离不开挑圈联靠四字真言。那么，非肿瘤分析的重中之重，在于数据的获取。我们都知道，TCGA数据库，只包含33种肿瘤信息，那么，对于非肿瘤的部分，需要从GEO或者专门的疾病数据库中获取，至于如何利用GEO数据库分析？一般有R语言，以及GEO2R在线网站两种方式，如今，有了仙桃工具，可以跨越科学上网的屏障，非常便利的获取分析结果。虽然目前只上线GPL570一个平台的数据，但是这个平台是目前测序数据量最大，应用最广泛的平台，完全满足我们日常挖掘分析，此外，技术小哥哥还在加班加点进行其他平台的数据清洗，相信不久后，更多的GEO数据集可以在仙桃工具上进行点点点式的分析。小伙伴们可以期待一下哦。
回顾一下，本文的复现，只需要依靠一个仙桃工具，联合一个互作软件，就能完美收官，这一波操作，是不是很赞。
文末彩蛋
此外，文末彩蛋，给大家列一下单基因的分析流程
怎么样，经过一系列的复现，是否现在摩拳擦掌，迫不及待地想要开始学习起来了，期待大家的复现之旅，也希望大家可以把自己在复现过程中遇到的问题发出来，我们可以在讨论区互动哦~
