环境对番茄果实的感官品质有深远的影响，其程度取决于基因、代谢物和感官属性之间良好调节和动态的相互作用。我们使用系统生物学方法来阐明调节感觉特征可塑性的复杂相互作用机制。

为了研究对环境具有挑战性的转录组学和代谢组学重塑并评估这种变异的感官后果，我们在坎帕尼亚地区（意大利）的两个不同地点种植了三个番茄品种Heinz 1706，其基因组被测序为参考，以及两个“本地”品种，San Marzano和Vesuviano。

番茄是全球最受欢迎和最广泛消费的蔬菜作物之一，其独特的水果品质特性可以通过环境条件强烈改变。对不同环境条件的反应取决于几个因素，包括单个基因型的遗传多样性和基因组可塑性。

任何性状的表型可塑性的发生和程度本身都是受遗传控制的特征，性状、个体和种群之间的水平不同。因此，功能性状的差异可以预测个体基因组对环境变化的反应差异，尽管这很少在现场进行实验测试。

在评估功能性状作为基因型如何响应环境变化的预测指标的重要性时，必须考虑个体之间的性状变异。事实上，这种可塑性的作用对于缓冲环境变化的不利影响至关重要。一个提出的假设是，表型可塑性可能受到基因复制事件的青睐，这些事件会产生冗余的基因组功能，这些功能可能会随着时间的推移而发散。

番茄果实的感官特性由一组感官属性定义，例如风味、水果外观和质地。风味被定义为味道和气味的组合。强烈的味道是糖异生增加，多糖水解，酸度降低以及糖和有机酸积累的结果，而香气是由挥发性化合物的复杂混合物和苦味原理，类黄酮，单宁和相关化合物的降解产生的。

果实颜色主要由类胡萝卜素和类黄酮决定，而质地特征除了角质层特性、细胞膨胀和果实形态外，主要受细胞壁结构控制。近年来，番茄果实的感官质量已在遗传和生化水平上进行了研究，以获得口感更好的新品种。

最近，传统番茄品种如圣马扎诺（SM）和维苏威（RSV）的基因组已被测序，被认为是水果质量参数的重要模型。SM起源于意大利南部的Agro Sarnese-Nocerino地区，生产细长的水果，具有特殊的苦甜味。RSV起源于同一地区维苏威火山的火山坡，由于其质地，生产出适合长期储存的小甜梨形水果。

剖析对环境线索的基因组和代谢反应的能力是理解水果品质性状可塑性的分子基础的关键。尽管有大量关于控制果实品质性状的基因组和代谢组学成分的信息，但迄今为止对控制这些性状的转录动力学（可塑性）知之甚少。整合不同组学数据集的系统生物学方法有助于阐明控制感官特性的复杂机制[23]。

这项工作的目的是量化对环境线索的转录反应程度，测量代谢活动并评估所鉴定的基因组变异的感官后果。我们采用了多层次（系统生物学）方法，结合了在两个不同产地生长的三个番茄品种Heinz 1706（H）、SM和RSV的基因组、转录组、代谢组和感官数据。

RNA测序和差异表达分析

按照前面描述的方案，从冷冻、均质和粉状的水果番茄样品中提取用于下游RNA测序和qPCR验证的总RNA。使用 Agilent 生物分析仪 2100 检查 RNA 质量。使用 TruSeq RNA 样品制备试剂盒 v2从 5.2 μg 的总 RNA 开始制备六个 RNA-seq 文库。

然后用Pippin Prep对文库进行大小选择，结果选择范围约为250-350 bp。cDNA 文库通过合成试剂盒 v3-HS 和 TruSeq 配对端簇试剂盒 v3-cBot-HS测序，使用 HiSeq 1000测序仪根据制造商的说明进行测序，以生成 100 bp 配对端读段。

使用CASAVA软件（Illumina Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥）分析测序读数，以进行解复用和FASTQ文件生成。使用RseQC软件检查读数质量。

RNAseq读数在S. lycopersicum cv上对齐。Heinz 1706 版本 2.40 基因组，圣马扎诺和维苏威诺 [20] 分别使用 TopHat 基因组。

使用袖扣（ver2.2.1）使用多读段校正对数1倍变化（FC）值模块进行转录组重建和差异表达基因（DEGs）和亚型（DEI）鉴定。每个品种都遵循该管道，并带有相应的参考注释，以指导基于参考注释的组装（RABT）以检测新基因/亚型。

使用罗氏转录器高保真cDNA合成试剂盒逆转录的1 μg总RNA进行实时定量RT-PCR。使用Power SYBR?绿色预混液（应用生物系统）使用7900HT快速实时荧光定量PCR系统（应用生物系统）进行扩增。

有25μl反应混合物含有：每个引物0.5μM和12.5μlSYBR GreenPCR预混液。相对定量由 ΔΔC 实现T方法。

DEG功能分类、GO富集分析和基因拷贝数检测

通过Blast2GO对新基因进行功能注释。植物MetGenMAP 用于在Bonferroni校正后的p值截止值为0.05的情况下进行GO富集分析。MapMan软件用于DEG和DEI的路径可视化。

根据在每个GO类别中检测到基因的频率，在频率分布表中绘制了富集感兴趣的GO类别中基因的倍数变化（FC）。FC落在这种频率分布的90%边界之外的基因被认为是“异常值”。

为了鉴定多拷贝基因家族，建立了所有Heinz 1706，San Marzano和Vesuviano基因的本地BLAST数据库，并在各自的数据库上对每个基因型的两个位置之间的DEG进行BLASTN搜索，以使用1e-30 e值阈值和大于72%的核苷酸身份来鉴定同源基因。分析经过改进，以保持每个主题的查询覆盖率大于 50% 的爆炸结果。

代谢组分析

如前所述[32，33]进行果实半极性代谢组的液相色谱-电喷雾电离-质谱（LC-ESI-MS）分析，稍作修改：用25.0ml冷的75%（v / v）甲醇，75.0%（v / v）甲酸提取1mg冷冻干燥，均质化的番茄果粉，加入10μgml - 1福莫诺丁。

使用混合研磨机40（Qiagen）在20Hz下振荡300分钟后，将样品在15°C下以20，000g离心4分钟;除去0.6ml上清液并转移到HPLC管中。对于每种基因型，从三个独立的池中进行至少两次独立提取。

LC-MS分析使用LTQ-Orbitrap Discovery质谱系统（赛默飞世尔科技）在正电喷雾电离（ESI）下运行，并与Accela U-HPLC系统（赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆）耦合。使用Phenomenex C18 Luna柱（150×2.0 mm，3 μm）进行液相色谱。

流动相由水-0.1%甲酸（A）和乙腈-0.1%甲酸（B）组成。梯度为：95%A：5%B（25分钟），在75分钟，40分钟等度内线性梯度为2%A：18%B，然后在0分钟内回到初始LC条件。每个样品进样2μl，在整个LC运行过程中使用230.800ml的流量。

使用在线Accela Surveyor光电二极管阵列探测器（PDA，赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆）从25到300 nm连续进行检测。代谢物通过对内标量的归一化以相对方式定量。使用以下参数进行ESI-MS电离：毛细管电压和温度设置为40 V和25 °C;护套和辅助气体流速分别为4和90。

喷雾电压设置为34 kV，管透镜设置为V。 通过将色谱和光谱特性与Pubchem数据库或代谢组学Fiehn实验室质谱加合物计算器（中的标准品和参考光谱进行比较来进行代谢物鉴定).如前所述，对果实异戊二烯进行液相色谱-常压化学电离-质谱（LC-APCI-MS）。

感官分析

感官分析由训练有素的六名评委组成的小组进行。对于两种环境中的每个品种，评估了0个属性：两个与外观有关（红色，颜色均匀性），五个与风味（酸，咸，甜度，风味，气味）有关，五个与质地有关（荧光度，硬度，膨胀度，多汁性和耐皮肤性）。

每位小组成员收到三个样本;然后，小组以10-<>的等级对不同的参数进行评级。方差分析（ANOVA）用于识别环境之间质量属性的显著差异。采用主成分分析（PCA）探索感官属性之间的关系，确定Acerra和Sarno感官特征的变异性。分析感官谱以评估基因型、环境及其相互作用对双向方差分析的影响。

转录组测序和组装

使用Illumina技术对来自意大利南部坎帕尼亚地区两个地点（即萨尔诺（Sa）和Acerra （Ac）生长的三个番茄（Solanum lycopersicum）品种（H，SM和RSV）的RNA-Seq文库进行了测序，每个样品平均获得39.7百万个片段。

H，SM和RSV读数映射到各自的基因组组装。这三个品种平均显示超过19，000个表达基因，其中17，382个先前被注释并在三个品种之间共享，平均有2，255个新品种位点。

总体而言，获得的转录本显示平均长度为1，852个碱基对（bp），平均N50为2，475 bp。新基因的功能注释允许将至少一个基因本体（GO）项分配给参考基因组SL20.2中鉴定的40%的新基因，8%的SM新基因和10%的RSV新基因。

3个番茄品种基因表达变异程度

H、SM和RSV20个品种在两地共表达164，19、680，19和590，993个转录本。H品种特异性表达615个基因的核心集，而不是分别在SM和RSV中表达669和1个基因（附加文件2：图S1）。

通过比较两种不同环境（Ac和Sa）的表达水平，计算每种基因型（H，SM和RSV）的差异表达基因（DEG）。报告了在H（801），SM（864）和RSV（1）中显示差异表达的基因数量。

有趣的是，大多数高表达的DEGs与所有基因型的果实品质有关。还研究了显示SM和RSV结构变异的果实品质基因。在与H相比，RSV和SM中显示变异的051，78个基因中，分别有89个和626个基因在SM和RSV中差异表达，包括大量编码转录因子/调节因子的基因。

在具有SM和RSV变异的184和24个基因型特异性基因中，9个和1个基因被证明在两种基因型中差异表达。在SM中具有变异的DEG主要由细胞壁酶（木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶，糖基转移酶等）代表，而在RSV中由转录因子代表。

涉及果实品质测定的DEGs调查

按照图所示的方案，进行了富集分析，以确定基因本体（GO）术语在每个基因型中（无论环境如何）（G），在每个环境中（无论基因型（E）如何）以及特定基因型×环境组合（G×E）中过度代表。

与环境相关的过度表示的GO术语如图所示。2b.Acerra特异性富集GO项与细胞壁，乙烯和天冬氨酸家族氨基酸有关，而在Sarno中与碳水化合物分解代谢，丝氨酸家族氨基酸代谢和胺代谢有关。

显示了与果实品质相关的 SM、SM × AC 和 SM × Sa 丰富 GO 术语。大多数富含SM的GO项与氨基酸和有机酸代谢有关。值得注意的是，尽管这两种环境共享丰富的GO项，但一般代谢中的特定部分在每次G×E相互作用中被动员起来。例如，SM×Ac过度代表的GO术语涉及氨基酸代谢与芳香族和天冬氨酸氨基酸家族有关，而SM×Sa GO与丝氨酸家族有关。

附加文件1：图S3，S4和S5显示了与氨基酸，乙烯代谢以及细胞壁和碳水化合物代谢相关的富含H和RSV的GO术语。在每个富集的GO术语类别中，大约10%的倍数变化（FC）值落在频率分布尾部的基因被标记为两个位置之间的“异常值”。

这种情况使我们能够鉴定和编目基因型塑料基因。SM异常基因包括细胞壁基因，主要是木葡聚糖内转糖基化酶水解酶（XTHs）和果胶酯酶，以及氨基酸相关基因，如脱羧酶和叶绿素结合蛋白。

转录调控过程和基因拷贝数变异

对于所有三种基因型，Acerra 中参与转录和翻译后 DEG 的数量都更高，其中 SM 显示的基因数量最多。还鉴定了两个位置之间差异表达的新亚型（DEI）和交替剪接（AS）事件。

特别是，在SM和RSV中都证明了与纤维素生物合成相关的差异表达亚型。此外，在H 4中，232个DEGs（39%）是多拷贝基因家族的成员，在SM中，269个（33%），在RSV中，316个（36%）。

大多数多拷贝家族包含两到三个拷贝，其中H和SM最多13个拷贝，RSV最多23个拷贝。与果实品质相关的GO类别包括155、145和140个DE基因，分别存在于SM、RSV和H的至少两个拷贝中。属于 XTH 家族的基因，如 Solyc03g093110 和 Solyc03g093120 显示出 03 个拷贝，具有很高的相似性，而 Solyc093080g03 和 Solyc093130g1 则显示了 7 个拷贝。