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“中医药”是目前国家大力扶持的科研方向，国自然中占比很高，有国家的大力支持，相信中医药的科研和发展必定日新月异。
有了扶持，怎么快速发展实践？国自然是国内科研圈子里的事情，可以按照国内的玩法，那涉及到SCI文章发表了？似乎还得参考当代医学研究的思路，从复杂的方剂中，寻找有效成分以及潜在调节靶点。很多药物已经有很好的临床疗效，但是在药理机制研究方面则大大受限。
这时候，就要用上“网络药理学”了，可以从大数据、大队列角度找到一些机制提示，再加上实验的论证，两者相辅相成，难题不就一步步瓦解了~
小云今天分享的这篇文章即是属于典型的网络药理学分析+干湿结合思路。研究起始于临床中已明确对糖尿病肾病(DKD)疗效的中成药针剂“肾康注射液（SKI）”，利用网络药理学筛选药物潜在靶点；同时利用5种疾病数据库，分析DKD潜在发病机制，最后将两个基因集进行整合，及初步获得了SKI对DKD的潜在分子机制。随后再通过干湿结合进行证明，从表型到机制，证据链完整，也就没有被质疑的空间，为中医的现代化研究开辟了新的道路。广大中医药方向的研究者们，不要再迟疑了，这篇文章就是只验证，未论述因果关系即可以发表，相加比非常高。
题目：基于网络药理学研究肾康注射液通过Keap1/Nrf2/Ho-1信号通路治疗糖尿病肾病的机制
杂志：Phytomedicine
影响因子：IF=7.9
发表时间：2023年9月
研究背景
糖尿病肾病(DKD)是糖尿病的常见并发症，在T2DM人群中约占20%-40%，超过40%的终末期肾病患者因DKD而发病。中医药防治DKD的作用机制及其应用尚需深入研究。SKI可显著降低DKD患者24小时尿蛋白定量，保护肾功能，延缓DKD进展，特别是对于终末期肾病患者。本研究拟深入探讨SKI对DKD的作用机制。
研究方法
首先，通过TCMSP(中药系统药理数据库和分析平台)对SKI药物的作用靶点进行分析；同时，利用GenGards、OMIM、Drugbank、TTD和Disgenet数据库等对DKD疾病的发病机制以及分子途径进行分析；将SKI的靶点基因和DKD的发病机制进行整合分析，筛选出潜在的药物作用靶点。根据上步分析初步选定氧化应激以及Keap1/Nrf2/Ho-1信号通路为SKI药物的治疗靶点。为了验证这个结论，在大鼠DKD模型中进行SKI药物处理，进行病理指标、分子指标检测；在体外细胞模型中，通过施加晚期糖基化终产物(AGEs)进行氧化应激胁迫，SKI处理后，检测细胞学指标、ROS水平以及分子通路表达。
主要结果
1.网络药理靶点预测
基于TCMSP数据库的网络药理学分析，共识别出280个SKI药物的潜在靶点；从5个疾病数据库中筛选出1197个DKD相关基因；将两者进行整合分析，共获得118个重合基因（图1A）。通过PPI蛋白相互作用分析，发现核心靶点为NOS3、HIF1A、AKT1等（图1B）。槲皮素、山奈酚和木犀草素可能是SKI治疗DKD的核心活性成分（图1C）。对靶点基因的功能富集分析，发现ROS、HIF-1信号通路等通路有差异（图1D-E）。因此，SKI可能通过影响氧化还原相关信号通路来调节AGEs诱导的氧化应激，预防DKD肾损伤。
图1网络药理靶点预测
2.SKI对DKD动物模型的表型影响
与对照组SD大鼠相比，DKD大鼠体重逐渐下降(p<0.01)。而SKI治疗组的体重自给药后第8周开始恢复（图2A）。同时，SKI治疗组大鼠的24小时尿蛋白水平显着降低（图2B）、血清Scr、Urea水平下降（图2C、D）、SKI组TC、TG、LDL均显着降低（p<0.01）（图2E-G）；以上结果均表明，SKI对DKD动物模型的表型有显著的改善。
图2SKI对DKD大鼠体重、24小时尿蛋白、肾功能和血脂的影响
3.SKI对肾组织keap1、nrf2、ho-1和gpx4mRNA表达和蛋白表达的影响
qPCR结果显示，相比于DKD模型组，SKI处理组的Keap1mRNA水平显著降低，而Nrf、Ho-1和Gpx4显著升高（图3A-B）；
图3 SKI对肾组织keap1、nrf2、ho-1和gpx4mRNA表达影响
免疫组化显示，Keap1、Nrf、Ho-1和Gpx4的蛋白表达水平与mRNA结果基本一致（图4）
图4 SKI对肾组织keap1、nrf2、ho-1和gpx4蛋白表达的影响
4.SKI可显著增强HK-2细胞活力
作者先通过CCK8实验对SKI浓度进行了筛选，最终表明4％的SKI可以促进细胞活性，且保持较低的细胞毒性水平。与AGEs模型组相比，SKI可显著增强HK-2细胞活力，且诱导HK-2细胞形态的改善（图5A-C）。DCFH-DA荧光探针染色检测发现，相较于对照组，AGEs刺激会显著升高HK-2细胞内ROS水平，而SKI可明显降低AGEs引起的ROS升高（图5D）。
图5SKI可显著增强HK-2细胞活力
5.SKI对HK-2细胞分子机制调节
通过免疫荧光检测，AGEs会降低Gpx4的荧光信号，而SKI处理则逆转这个趋势，显著提高Gpx4的荧光亮度（图6A）。WB检测发现，AGEs处理会提高Keap1蛋白表达，而SKI的施加则降低Keap1水平；AGEs组中的Nrf2和Gpx4蛋白表达显著降低，而SKI施加会促进Nrf2和Gpx4的表达（图6B-C）。
图6SKI对HK-2细胞的分子通路调节
文章小结
本文是属于典型的网络药理学分析+干湿结合思路。研究的起始在于临床中已明确疗效的方剂，在分子机制的探讨上，网药是一大利器。从药物和疾病两个方向，筛选出方剂的潜在靶点，再通过干湿结合，从表型到机制，证据链完整，也就没有被质疑的空间，为中医的现代化研究开辟了新的道路。这种干湿结合的研究方法很容易复现，充分的展现了生物信息学作为工具所发挥的作用。
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