乳腺癌严重威胁女性生命健康，根据2020年WHO世界癌症负担数据分析，乳腺癌发病率已经超越肺癌，成为全球发病率最高的癌症[1]。全球每年新增乳腺癌患者高达230万，每年死亡病例高达69万，其高发病率和高致死率成为威胁女性生命健康的第一杀手[2]。临床发现乳腺癌细胞具有极强的增殖、侵袭、转移能力，阿霉素是临床上治疗乳腺癌的常用药物，但阿霉素治疗乳腺癌过程中易产生耐药性，很难达到预期的治疗效果[3-5]。

中成药因其具有高效低毒、多途径、多靶点、整体调控等优势，已被临床广泛使用[6-8]，研究表明多种中药活性成分能够通过多途径、多靶点调控肿瘤细胞关键节点蛋白表达、促进肿瘤细胞发生凋亡、逆转乳腺癌多药耐药，表现出对抗乳腺癌多药耐药的潜力[9-10]。

防己是防己科植物粉防己Stephania tetrandra S. Moore的干燥根茎，别名粉防己、粉寸己、汉防己，主要分布于安徽、浙江、江西、湖南、湖北、福建、台湾、广东、广西和海南等地[11-12]。防己中含有生物碱、黄酮、多糖、有机酸等丰富的化学成分[13-15]，具有抗肿瘤、抗高血压、抗炎、抗纤维化等广泛的药理作用[16]。本研究基于网络药理学[17]及分子对接技术筛选防己活性生物碱成分抗乳腺癌MCF-7/ ADR耐药的相关靶点和通路，并将筛选后的活性成分与靶蛋白进行分子对接，采用体外实验验证防己活性生物碱调控相关通路关键靶点逆转乳腺癌耐药的作用机制。

1 防己生物碱类活性成分及靶点筛选

通过TCMSP数据库以OB≥20%、DL≥0.10作为筛选标准，得到4个符合条件的防己生物碱类单体见表1。

利用SwissTargetPrediction在线预测4种生物碱单体的作用靶点，共得到332个靶点。通过Cytoscape 3.9.1软件，对数据进行可视化处理分析，并构建“成分-靶点”网络（图1）。

2 乳腺癌阿霉素耐药靶点的获取

在GeneCards上搜集乳腺癌阿霉素耐药疾病靶点，设置关联度≥20，得到490个靶点。其中防己生物碱类4个单体的作用靶点与疾病靶点存在84个交集靶点（图2）。

3 PPI网络的构建及核心靶点筛选

利用STRING 11.5数据库，导入交集靶点，获得PPI网络（图3-A）。采用Cytoscape 3.9.1软件、CytoNCA插件进行网络分析，并且将点度中心性、介度中心性、接近中心性≥所有节点的中位数设定为筛选标准，筛选得到7个核心靶点（图3-B），分别为蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、HSP90AA1、原癌基因SRC、PIK3CA、Caspase-3、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、MAPK1。

4 GO功能及KEGG通路富集分析

通过DAVID 6.9数据库对防己生物碱类活性成分和疾病的交集靶点进行GO功能富集分析，设定FDR≤0.05，共获得GO功能590条，其中435条BP、64条CC、91条MF。选取前10的条目通过微生信网进行可视化分析，见图4-A。

通过DAVID 6.9数据库对防己生物碱类活性成分和疾病的交集靶点进行KEGG通路富集分析，设定FDR≤0.05，得到148条通路，选取前20的条目通过微生信网进行可视化分析，见图4-B。结果表明，防己生物碱类活性成分与乳腺癌阿霉素耐药密切相关的信号通路为钙信号通路、环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）-cGMP依赖性蛋白激酶（cGMP dependent protein kinase，PKG）信号通路、Apenlin信号通路、维甲酸诱导基因-I（retinoic acid-inducible gene-I，RIG-I）样受体信号通路等。

5 “防己生物碱类活性成分-靶点-通路”网络的构建

将防己生物碱类活性成分、核心靶点、KEGG富集分析富集度前20的通路导入Cytoscape 3.9.1软件绘制“防己生物碱类活性成分-靶点-通路”网络图，见图5。

6 分子对接验证

以N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱、甜菜碱为配体，Caspase-3、AKT1、MAPK1、HSP90AA1、PIK3CA、EGFR、SRC为受体，利用Autodock Tools1.5.7软件，进行分子对接，结果显示，小于?4 kJ/moL的占53.57%，除EGFR和粉防己碱外，其余成分与受体间结合能均小于0 kJ/moL。各成分与AKT1、Caspase-3、HSP90AA1、MAPK1、PIK3CA、SRC、EGFR显示良好的结合活性。其中N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱以及甜菜碱与Caspase-3结合活性最好，对接演示见图6。

7 防己生物碱类活性成分对MCF-7、MCF-7/ ADR细胞增殖的影响

如图7所示，N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱和甜菜碱对MCF-7、MCF-7/ADR细胞均具有增殖抑制作用。根据给药浓度和抑制率进行线性回归，计算N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱和甜菜碱对MCF-7细胞的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）分别为14.77、14.47、13.95、22.08 μmol/L，对MCF-7/ADR细胞的IC50分别为15.13、17.33、14.20、25.15 μmol/L，说明这4种生物碱能够逆转乳腺癌MCF-7/ADR耐药细胞的耐药性，后续实验剂量参考IC50值进行设定，MCF-7细胞的给药剂量为N-甲基毛果芸香碱14 μmol/L、光千金藤碱14 μmol/L、粉防己碱13 μmol/L、甜菜碱22 μmol/L，MCF-7/ADR细胞的给药剂量为N-甲基毛果芸香碱15 μmol/L、光千金藤碱17 μmol/L，粉防己碱14 μmol/L、甜菜碱25 μmol/L。

8 防己生物碱类活性成分对MCF-7、MCF-7/ ADR细胞形态的影响

采用倒置显微镜、荧光显微镜观察N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱、甜菜碱对MCF-7、MCF-7/ADR细胞形态的影响，如图8所示，防己生物碱类活性成分可以明显改变MCF-7、MCF-7/ADR细胞的形态，并且出现部分细胞变圆漂浮现象；荧光显微镜下各给药组细胞出现凋亡小体，且细胞膜破碎明显，细胞排列稀疏，细胞核呈现较强的荧光。

9 流式细胞仪检测防己生物碱类活性成分对MCF-7、MCF-7/ADR细胞凋亡的影响

如图9所示，N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱、甜菜碱诱导MCF-7、MCF-7/ADR细胞凋亡，对MCF-7细胞的凋亡率分别为（26.22± 0.47）%、（14.38±0.35）%、（28.71±0.64）%、（19.67± 0.26）%，大部分凋亡细胞处在G1、G2期，判定为早期凋亡；对MCF-7/ADR细胞的凋亡率分别为（17.94±0.29）%、（13.75±0.86）%、（21.51±0.51）%、（16.95±0.37）%，大部分凋亡细胞处在G1、G2期，判定为早期凋亡。

10 防己生物碱类活性成分对MCF-7、MCF-7/ ADR细胞HSP90AA1、PIK3CA、MAPK1和Caspase-3蛋白表达的影响

如图10、11所示，N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱和甜菜碱作用于MCF-7、MCF-7/ ADR细胞48 h后，HSP90AA1、PIK3CA、MAPK1蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01），Caspase-3蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）。

讨论

目前中药逆转乳腺癌阿霉素耐药的研究已取得了进展，但肿瘤耐药机制复杂，且中药成分众多，网络药理学在有效成分以及疾病靶点筛选得到了广泛的应用，在一定程度上可以缩小研究的范围和明确研究的目的；分子对接技术将成分靶点与疾病靶点相结合，以虚拟评价的方式验证网络药理学的预测结果。进一步采用网络药理学方法，筛选防己生物碱类活性成分逆转乳腺癌阿霉素耐药的潜在靶点及作用通路，结果发现N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱、甜菜碱4个活性成分主要作用于SRC、EGFR、HSP90AA1、AKT1、MAPK1、PIK3CA、Caspase-3 7个核心靶点。

分子对接结果显示N-甲基毛果芸香碱与Caspase-3、MAPK1、EGFR、HSP90AA1、PIK3CA和SRC有良好的结合活性（结合能＜?4 kJ/moL）；光千金藤碱与Caspase-3、MAPK1和PIK3CA有良好的结合活性（结合能＜?4 kJ/moL）；粉防己碱与Caspase-3、HSP90AA1、MAPK1和PIK3CA有良好的结合活性（结合能＜?4 kJ/moL）；甜菜碱与Caspase-3、PIK3CA有良好的结合活性（结合能＜?4 kJ/moL），其中N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱以及甜菜碱与Caspase-3结合活性最好。KEGG通路富集分析结果表明，防己活性生物碱类成分可能作用于钙信号通路、cGMP-PKG信号通路、RIG-I样受体信号通路、Apenlin信号通路等通路来逆转乳腺癌阿霉素耐药。

体外实验结果显示，N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱、甜菜碱4个防己生物碱类活性成分均对MCF-7、MCF-7/ADR细胞具有增殖抑制作用，能够改变肿瘤细胞形态，诱导肿瘤细胞凋亡，进一步对关键通路节点蛋白检测发现，4种生物碱对MCF-7、MCF-7/ADR细胞HSP90AA1、PIK3CA、MAPK1、Caspase-3蛋白均具有调节作用。

HSP90AA1[18-20]、PIK3CA[22-26]、MAPK1[27-28]是诱发肿瘤发生的标志性蛋白，这4种生物碱能够显著下调HSP90AA1、PIK3CA、MAPK1蛋白表达，说明能够抑制肿瘤细胞增殖；Caspase-3[29-32]蛋白是肿瘤细胞凋亡的启动子，这4种生物碱能够显著上调Caspase-3蛋白表达，说明能够诱发肿瘤细胞凋亡。

实验结果说明，N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱和甜菜碱可以调控乳腺癌MCF-7/ADR细胞的Caspase-3、MAPK1、HSP90AA1、PIK3CA关键靶点，诱导细胞发生凋亡，逆转乳腺癌耐药。本研究采用网络药理学、分子对接技术和体外细胞实验明确了防己逆转乳腺癌阿霉素耐药的药效物质基础、潜在作用靶点及通路，为防己生物碱类成分逆转乳腺癌阿霉素耐药的研究奠定了研究基础，也为解决临床乳腺癌阿霉素耐药提供有效方案参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：杨 燚，王毛毛，于 淼，季宇彬，李文兰，辛国松，李海茹． 基于网络药理学、分子对接和体外实验探讨防己生物碱类活性成分逆转乳腺癌耐药的作用机制 [J]. 中草药, 2023, 54(9):2841-2851.